Лаборатория молекулярной и экологической физиологии

Уникальную особенность лаборатории представляет собой применяемый нами комплекс высокотехнологичных методов биохимии, цитологии, молекулярной биологии и физиологии растений.

Современные физиологические методы изучения растений включают определение параметров флуоресценции хлорофилла in vivo и измерения газообмена растений in vivo.

DUAL-PAM 100 (Walz, Германия) – Универсальный высокоточный импульсный флуориметр предназначен для неинвазивного изучения процессов фотосинтеза методом высокоскоростного одновременного измерения интенсивности флуоресценции хлорофилла и поглощения P700. Прибор позволяет получать информацию об эффективности конвертации энергии как системой ФС I так и системой ФС II одновременно. Имеется опционная возможность измерения других ключевых фотосинтетических параметров (pH, мембранный потенциал, НАДФ).

GSF-3000 (Walz, Германия) – высокоточный инфракрасный (СО2/Н2О) газоанализатор с контролем СО2, влажности, температуры и освещенности, предназначенный для работы в полевых и лабораторных условиях с возможностью параллельного измерения газообмена и сопряжения с импульсными флуориметрами DUAL-PAM 100 и IMAGING-PAM MINI.

Спектрофотометрические исследования проводятся с помощью двухлучевого спектрофотометра UV-2600 (Shimadzu, Япония). Спектрофотометр UV-2600 c одиночным монохроматором Черни-Тернера, высокочувствительным детектором на базе фотоэлектронного умножителя R-928 и двумя источниками света — галогеновой и дейтериевой лампами — позволяет проводить измерения в спектральном диапазоне185–900 нм (±0,1 нм) при скорости сканирования от 4000 до 0.5 нм/мин. Спектрофотометр отличается высокой стабильностью нулевой линии (±0,0003 Abs в спектральном диапазоне 200-860 нм) и крайне низким уровнем шума (менее 0,00003 Abs для 500 нм). Фотометрический диапазон измерений составляет -5 – +5 Abs, при этом точность измерений (при 0,5 Abs) составляет ±0,002 Abs, а воспроизводимость составляет ±0,001 Abs.

Прибор приобретен в рамках выполнения федерального проекта «Развитие передовой инфраструктуры для проведения исследований и разработок в Российской Федерации» национального проекта «Наука» (соглашение с Министерством науки и высшего образования № 075-15-2019-1558).

Метод ПЦР в режиме реального времени в сочетании с обратной транскрипцией позволяет с высокой точностью определять уровни экспрессии генов интереса. Амплификатор с детекцией в режиме реального времени Eco™ Real-Time PCR System (USA) представляет собой универсальную, современную, высокотехнологичную систему. Прибор оснащен термоблоком, позволяющим обеспечивать быстрый нагрев и охлаждение реакционных смесей, а также поддержание заданной температуры в ячейках планшета с точностью ±0.1º C. Амплификатор позволяет проводить мультиплексный анализ яркости до 4-х флуорофоров одновременно, обладает функцией анализа температурных кривых плавления (High Resolution Melt) и заводской калибровкой для флуорофоров SYBR Green I, FAM, HEX, VIC, ROX, Cy5 и Q670.

Метод гибридизации РНК-РНК in situ является одним из примеров успешного сочетания этих подходов. Этот метод позволяет «наложить функцию на структуру», то есть, определить с высоким уровнем разрешения, в каких клетках растения активны те или иные гены интереса. Метод включает молекулярное клонирование кДНК генов интереса, получение специфичных РНК-зондов путем in vitro транскрипции, изготовление РНК-содержащих срезов, микроскопические техники.

Фото. Локализация экспрессии меристемспецифичного гена SkKNOX1 в кончиках побегов Selaginella kraussiana методом РНК-РНК гибридизации in situ. А: детекция локализации транскриптов SkKNOX1 в апикальной меристеме побега Selaginella kraussiana с помощью антисенс-зондов. Б: контроль (гибридизация с сенс-зондами). АМП- апикальная меристема побега, АИ- единственная апикальная инициаль, ПЛ- примордий листа, звездочка указывает на зону заложения листового примордия в АМП.

Метод Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) – один из методов конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Он позволяет проводить сравнительные исследования подвижности интегральных компонентов гранальных мембран в хлоропластах (липидов и хлорофилл-содержащих белков), на основании чего делается заключение о скоростях диффузии компонентов ЭТЦ фотосинтеза, пигмент-белковых комплексов тилакоидных мембран, процессах репарации фотосистем и др.

Фото. Динамика восстановления флуоресценции хлорофилла и маркера липидов после фотообесцвечивания лазером (метод FRAP) в образцах, выделенных из листьев дикого типа (WT) Arabidopsis (At) и ячменя (Hv), а также мутантов chlorina Arabidopsis (ch1-3), и ячменя (clof2). Приведены примеры постановки экспериментов FRAP с визуализацией процесса восстановления флуоресценции хлорофилла фотообесцвечиваемого участка (a) и восстановления флуоресценции липидного аналога BODIPY (b) во времени. Результат кратковременной обработки лазером в виде фотообесцвечивания участка тилакоидной мембраны представлен на изображениях в точке ноль (t=0s); состояние тилакоидных мембран до фотообесцвечивания представлено на пред-блич изображениях, обозначенных pb (prebleach images), динамика восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания прослежена в течение 175 с для хлорофилла (a) и 125 с для BODIPY (b). Эксперименты по фотовыцветанию хлорофилла были выполнены на образцах интактных хлоропластов (intact chloroplast, с) и использованы для оценки мобильности ССКII и ФСII, тогда как FRAP BODIPY был проведен на образцах тилакоидных мембран после шокирования хлоропластов (broken chloroplast, c) и позволил оценить скорости диффузии липидов в тилакоидной мембране. На графиках (d-k) приведены по три типичные кривые восстановления интенсивности флуоресценции после фотообесцвечивания хлорофилла (d-g) и BODIPY (h-k). На графиках приведены значения размера мобильной фракции (средние и стандартные отклонения по результатам измерений, полученных в 6-7 независимых экспериментах). * показывает достоверные отличий значений, полученных для мутантов ch1-3 и clof2 от соответствующего каждому мутанту дикого типа при уровне значимости p < 0.05 согласно тесту Стьюдента.

Другие методы включают вестерн-блоттинг, спектрофотометрические исследования, высококопийное клонирование, ПЦР-технологии, агробактериальную трансформацию Arabidopsis thaliana и др. В работе мы используем оборудование Центра коллективного пользования научным оборудованием «Клеточные и молекулярные технологии изучения растений и грибов» Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН и Ресурсного Центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий»